Attachment sites and receptors of hepatitis B virus
HE Chuan, JING Xue, GAO Pu-jun
Department of Gastroenterology, First Affiliated Hospital. Jilin University, Changchun 130021, China
众多学者对HBV嗜肝性机制得出共识：HBV膜蛋白直接与肝细胞膜上相应的受体结合，继而膜融合，通过胞饮作用内吞入胞；或者HBV与细胞外液中某一中介分子结合形成复合体，再与肝细胞膜上其相应的受体结合入胞。但目前仍不能确定膜受体及中介分子是什么。现就近年来HBV嗜肝机制研究综述如下。
一、HBV与肝细胞受体结合位点
HBV表面蛋白分为大分子蛋白（LHBsAg，L蛋白）、中分子蛋白（MHBsAg，M蛋白）和小分子蛋白（SHBsAg，S蛋白）。L蛋白是由N端的preS1、中间的preS2以及C末端的S蛋白组成的。目前研究集中于L蛋白与肝细胞膜相关受体结合的准确区间。
早期研究得出：HBV与肝细胞结合的相应配体存在于L蛋白的preS1（21-47）[1]。Glebe等[2]为了研究preS1氨基末端的阻断作用，利用体外原代树鼩肝细胞系统与从患者血浆中分离出的天然HBV颗粒共同培养，发现preS1氨基末端(2-48)能够有效阻断病毒感染：且preS1（28-48）可以增强对病毒的抑制力，而preS1（49-78）则无阻断能力。随着研究的深入，Engelke等[3]发现preS1（11-21）中的一个氨基酸缺失或点突变，均会使HBV失去感染活性，得出高度保守的preS1序列是病毒感染所必需的。
Gripon等[4]提出L蛋白末端的豆蔻酰化在HBV侵入肝细胞过程中是必不可少的，缺失豆蔻酰化的preS1完全失去感染能力。Barrera等[5]研究后验证preS1前45个氨基酸组成的豆蔻酰基化合成多肽，能竞争抑制HDV感染多种细胞系。以上说明，虽然豆蔻酰化是一种数量并不丰富的氨基酸簇，但不能除外此特殊位置的分子能起到暴露或保护整个蛋白特殊区域的作用。因此，酰基化可能影响蛋白构象进而与宿主细胞的表面成分有特殊相互作用，包括识别可能的分子受体。
多数学者认为L蛋白的preS1是结合的重要区域，但也有不同观点。preS2具有细胞渗透能力，Stoeckl等[6]认为，这种作用正是通过preS2与S序列交界处存在易位序列（translocation motif，TLM）。他们利用鸭乙型肝炎病毒进行模拟发现，完整的preS2-TLM才能感染肝细胞，推测此蛋白序列可能是打开HBV入肝的门户。但Gudima等[7]和Blanchet和Sureau[8]却得出相反的研究结论，并提出preS1的N端前75个氨基酸是HBV入侵肝细胞最为重要的。目前关于HBV受体结合位点的区间，仍存在分歧。
二、HBV膜受体
病毒受体是位于宿主细胞表面能被病毒识别并与之结合，从而引起病毒感染的分子复合物。其本质是蛋白聚糖、糖蛋白、脂类或糖脂，大多属于蛋白质。
1. 糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）：又称粘多糖，是由无支链多糖组成的己糖氨基酸重复序列，是细胞外基质和质膜的重要组成部分。其中，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan, HSPG）是多种病毒的受体，它的长的碳链为病毒进入宿主细胞提供了便利条件。Guibinga等[9]首次发现从莫洛尼氏鼠白血病病毒和人类免疫缺陷病毒分离出的无感染性、无外膜蛋白的逆转录病毒类似颗粒（retrovirus-like particles，VLP)能够结合但不感染靶细胞。使用GAG酶消化Hela细胞系细胞膜表面，结果VLP颗粒与膜结合降低。推断逆转录病毒早期感染可能是由HSPG或其他GAG分子介导。同样，Schulze等[10]，用肝素酶除去HepaRG细胞系表面的酸性糖类结构后，HBV感染颗粒不能有效的与肝细胞结合且结合位点显著减少；加入聚乙二醇后，HBV结合能力显著增加。他们认为HSPG只作为依赖于L蛋白完整PreS区的初级受体，推断存在更高级、亲和力更强的受体。而此高级受体与L蛋白preS1甘氨酸-2的豆蔻酰化有密切关系，聚乙二醇则是二者结合的促进剂。Leistner等[11]利用primary Tupaia细胞系得出相似结果，不除外多种病毒包括HBV具有共同的侵入细胞路径。但HSPG作为HBV受体实验较少，尚需充分证明上述观点。
2. 膜联蛋白Ⅱ：Mehdi发现重组乙型肝炎表面抗原（rHBsAg）可与正常人肝细胞膜通过载脂蛋白H，即β2糖蛋白I（β2-glycoprotein Ⅰ，β2-GPI）在膜外结合[12]。因β2-GPI参与组成脂蛋白，推断HBV很可能与β2-GPI结合随乳糜微粒和高密度脂蛋白入肝，S蛋白是结合位点。Stefas 等[13]验证了人血清中存在HBV-β2-GPI复合物。与Mehdi不同的是，他观察到作为中介分子的β2-GPI与L蛋白的preS1糖基化形式有较强的结合力，即结合HBV完整Dane颗粒，而这种结合方式能暴露更多的S蛋白，有利于HBV与β2-GPI结合。高普均等首次筛选出肝癌细胞株SMMC-7721表面存在与人β2-GPI特异结合的蛋白[14-16]。经测序鉴定，此结合蛋白与膜联蛋白Ⅱ（Annexin A2）具有高度同源性（98%）。膜联蛋白Ⅱ是广泛存在于细胞内的一类钙结合蛋白，与Ca2+结合可进一步与磷脂结合，称为钙依赖磷脂结合蛋白。活化后经某种传导系统传递胞外信息，可以引起细胞效应或进入细胞影响新陈代谢。他们推测，β2-GPI血清中含量较丰富，在血中形成HBV-β2 GPI复合物，进而与受体膜联蛋白Ⅱ结合进入肝细胞。此研究为HBV嗜肝机制提供了一个新的研究思路。
3. 去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）：是一种跨膜蛋白，显著且特异性表达于肝脏窦状隙和基底外侧的细胞表面。ASGPR主要由两个亚基H1和H2组成，二者联合具有内吞作用，被用于介导药物和基因的肝靶向递送以及肝脏成像等方面的研究。Diao等[17]发现ASGPR不仅能与HBV感染肝细胞，还能与其抗体在动物体内形成的复合物，诱发宿主体内的自身免疫反应，使急性乙型肝炎向慢性转化，加重组织学损伤。Owada等[18]使用神经氨酸酶（neuraminidase，NA），即唾液酸酶预处理天然HBV后，与HepG2细胞共同培养。实验结果显示，去唾液酸基后的HBV与ASGPR结合率显著增高，是未处理组的1000倍；这种结合可被去唾液酸的胎球蛋白和钙离子螯合剂EDTA阻断。早期研究表明[19]，内皮细胞有去唾液酸活性，肝脏内皮细胞上存在有NA。因此，HBV很可能被内生NA去唾液酸化后与ASGPR结合。在HepG2肝细胞最初培养的24h内，检测到了HBV DNA和共价闭合环状DNA，这说明HBV在与ASGPR结合后进入肝细胞。但24h后上述二者逐渐衰减，未观察到病毒复制，因此需进一步研究ASGPR在HBV入肝中所起的作用。
4. 鳞状细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCCA）：最早发现于宫颈癌组织，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族。De Falco等[20]分离HepG2细胞质膜，用自行建立的四价preS1（21-47）的衍生物与之结合。经亲和色谱分析，分子质量为44×103的HBV相关结合蛋白（HBV-binding protein，HBV-BP）与SCCA有高度的一致性，只有三个氨基酸的差异。重组HBV-BP能够与preS1紧密结合，使病毒结合能力增加了2个数量级。故认为：SCCA在HBV侵入肝细胞过程中起着关键作用。Xia等[21]的动物实验也表明，过量表达的SCCA可以使HBV在肝脏细胞中长期存在。但不除外SCCA只是初步感染的受体，可能有未知的分子对HBV感染起着推动作用。有不同观点[22]认为preS1（21-47）诱导的SCCA在细胞表面过度表达为病毒侵入提供了“便利条件”；而介导HBV有效感染肝细胞的真正受体是额外加入的二甲亚砜。Beneduce等[23]经大样本分析后得出血清中SCCA-IgM免疫复合物可能是诊断肝癌更敏感、更特异的血清标志物。SCCA的病理生理作用尚不明确，其在HBV侵入肝细胞、在肝癌形成，抑或是同时具备上述二者作用尚无定论。此观点仍需更有力的实验证实。
5. 其他因素：羟肽酶D（Carboxypeptidase D，gp180）是鸭乙型肝炎病毒的L蛋白与肝细胞结合的依赖蛋白。Urban[24]研究发现gp180的C端与HBV preS区有较强结合力，是与病毒结合的隐藏受体。gp180与L蛋白（86-115）形成低亲和力的初级复合物；受体C区短α螺旋的前端形成一种连续的拉链式的随机组合序列，有利于逃避免疫监视，这二者均是感染肝细胞所必须的。他们推断，尚未明确的高亲和力受体间相互作用可能是通过保留能够适应结构的蛋白来实现的。Maenz等[25]利用原代鸭肝细胞系和肾细胞系进行研究，推断在糜蛋白酶的作用下鸭乙型肝炎病毒暴露膜融合区，通过gp180介导与细胞结合。上述鸭乙型肝炎病毒的感染模式可能为人HBV感染的研究提供真相。也有人利用重组preS1与HBV结合特性[26]，发现连接蛋白是一种呈线性基序的蛋白，经BLAST数据库分析后，鉴定是脂蛋白酶（lipoprotein lipase）。脂蛋白酶是脂蛋白代谢过程中的关键酶，很可能形成“酶桥”影响preS1与HBV的结合作用。但此方面研究资料甚少，尚无更确凿证据。
三、问题与展望
目前，虽然仍未确定HBV的膜受体及中介分子，但上述结论为今后的深入研究提供了极有意义的方向。现HBV感染肝细胞主要存在以下两个问题，第一，研究手段尚不能完全模拟HBV在体内的自然感染情况。近年建立的新型HepaRG细胞系[27]支持完整HBV感染及复制，最大特点是能够测到HBV cccDNA，它是目前为止建立的第一个人肝脏祖细胞系，这对于研究肝脏祖细胞的可塑性、细胞分化和致癌机制有重要意义。现国外仅有8个实验利用此细胞系开展HBV感染肝细胞机制的研究，国内尚处于空白。在动物模型方面，有研究示树鼠句的肝细胞对HBV有易感性[28]，这可能改善HBV动物模型缺乏的现状。上述两种研究平台能否成为更理想的模型尚需进一步论证。第二，HBV受体种类和性质较为复杂。有些情况下某些膜蛋白确有结合HBV的能力，但并不介导细胞的内吞作用，或者这种结合可能引起HBV真受体分子构象的改变，起到协同作用。这些可能存在的情况需通过多种方法进一步论证。
HBV侵入肝细胞机制仍存在着广阔的研究空间。深入阐明病毒表面亚单位结构及其与细胞受体相互作用的原理，这将对阐明病毒感染机制和阻断感染药物的设计和筛选作出极其重要的贡献。
参 考 文 献
[1]Neurath AR, Seto B, Strick N. Antibodies to synthetic peptides from the preS1 region of the hepatitis B virus (HBV) envelope (env) protein are virus-neutralizing and protective. Vaccine, 1989, 7: 234-236.
[2]Glebe D, Urban S, Knoop EV, et al. Mapping of the hepatitis B virus attachment site by use of infection-inhibiting preS1 lipopeptides and tupaia hepatocytes. Gastroenterology, 2005, 129: 234-245.
[3]Engelke M, Mills K, Seitz S, et al. Characterization of a hepatitis B and hepatitis delta virus receptor binding site. Hepatology, 2006, 43: 750-760.
[4]Gripon P, Cannie I, Urban S. Efficient inhibition of hepatitis B virus infection by acylated peptides derived from the large viral surface protein. J Virol, 2005, 79: 1613-1622.
[5]Barrera A, Guerra B, Notvall L, et al. Mapping of the hepatitis B virus pre-S1 domain involved in receptor recognition. J Virol, 2005, 79: 9786-9798.
[6]Stoeckl L, Funk A, Kopitzki A, et al. Identification of a structural motif crucial for infectivity of hepatitis B viruses. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103: 6730-6734.
[7]Gudima S, Meier A, Dunbrack R, et al. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. J Virol, 2007, 81: 4343-4347.
[8]Blanchet M, Sureau C. Infectivity determinants of the hepatitis B virus pre-S domain are confined to the N-terminal 75 amino acid residues. J Virol, 2007, 81: 5841-5849.
[9]Guibinga GH, Miyanohara A, Esko JD, et al. Cell surface heparan sulfate is a receptor for attachment of envelope protein-free retrovirus-like particles and VSV-G pseudotyped MLV-derived retrovirus vectors to target cells. Mol Ther, 2002, 5(5 Pt 1): 538-546.
[10]Schulze A, Gripon P, Urban S. Hepatitis B virus infection initiates with a large surface protein-dependent binding to heparan sulfate proteoglycans. Hepatology, 2007, 46: 1759-1768.
[11]Leistner CM, Gruen-Bernhard S, Glebe D. Role of glycosaminoglycans for binding and infection of hepatitis B virus. Cell Microbiol, 2008, 10: 122-133.
[12]Mehdi H, Kaplan MJ, Anlar FY, et al. Hepatitis B virus surface antigen binds to apolipoprotein H. J Virol, 1994, 68: 2415-2424.
[13]Stefas I, Rucheton M, D扐ngeac AD, et al. Hepatitis B virus dane particles bind to human plasma apolipoprotein H. Hepatology, 2001, 33: 207-217.
[14]Gao YH, Gao PJ, Wang D, et al. Studies on the association between beta 2-glycoprotein I and hepatotropism of hepatitis B virus. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2006, 14: 569-571.
高沿航,高普均,王丹，等.β2糖蛋白Ⅰ与乙型肝炎病毒嗜肝性的关系.中华肝脏病杂志,2006,14:569-571.
[15]Gao YH, Gao PJ, Wang D, et al. Expression of beta-2glycoprotein I receptor on membranes of hepatoma cell line SMMC-7721.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 2006, 14: 1731-1734. (in Chinese)
高沿航,高普均,王丹,等.SMMC 7721肝癌细胞膜上β2糖蛋白Ⅰ受体表达，世界华人消化杂志,2006,14:1731-1734.
[16]ShiY, Liu YW, Gao PJ, et al. Identification of the β2GP I binding receptor on hepatocyte membrane. Zhonghua Yixue Zazhi, 2007, 87: 2429-2431. (in Chinese)
时阳,刘雅文,高普均,等.肝细胞膜上β2糖蛋白I受体的鉴定.中华医学杂志,2007,87:2429-2431.
[17]Diao J, Slaney DM, Michalak TI. Modulation of the outcome and severity of hepadnaviral hepatitis in woodchucks by antibodies to hepatic asialoglycoprotein receptor. Hepatology, 2003, 38: 629-638.
[18]Owada T, Matsubayashi K, Sakata H, et al. Interaction between desialylated hepatitis B virus and asialoglycoprotein receptor on hepatocytes may be indispensable for viral binding and entry. J Viral Hepat, 2006, 13: 11-18.
[19]Wisse E, Braet F, Luo D, et al. Structure and function of sinusoidal lining cells in the liver. Toxicol Pathol, 1996, 24: 100-111.
[20]De Falco S, Ruvoletto MG, Verdoliva A, et al. Cloning and expression of a novel hepatitis B virus-binding protein from HepG2 cells. J Biol Chem, 2001, 276: 36613-36623.
[21]Xia HB, Chen ZY, Chen XG. Overexpression of hepatitis B virus-binding protein, squamous cell carcinoma antigen 1, extends retention of hepatitis B virus in mouse liver. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2006, 38: 484-491.
[22]Pontisso P, Calabrese F, Benvegn L, et al. Overexpression of squamous cell carcinoma antigen variants in hepatocellular carcinoma. Br J Cancer, 2004, 90: 833-837.
[23]Beneduce L, Castaldi F, Marino M, et al. Squamous cell carcinoma antigen-immunoglobulin M complexes as novel biomarkers for hepatocellular carcinoma. Cancer, 2005, 103: 2558-2565.
[24]Urban S. Binding of duck carboxypeptidase D to duck hepatitis B virus. Methods Mol Med, 2004, 95: 199-212.
[25]Maenz C, Chang SF, Iwanski A, et al. Entry of duck hepatitis B virus into primary duck liver and kidney cells after discovery of a fusogenic region within the large surface protein. J Virol, 2007, 81:5014-5023.
[26]Deng Q, Zhai JW, Michel ML, et al. Identification and characterization of peptides that interact with hepatitis B virus via the putative receptor binding site. J Virol, 2007, 81: 4244-4254.
[27]Gripon P, Rumin S, Urban S, et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99:15655-15660.
[28]Glebe D, Aliakbari M, Krass P, et al. Pre-s1 antigen-dependent infection of Tupaia hepatocyte cultures with human hepatitis B virus. J Virol, 2003, 77: 9511-9521.
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